下游处理的科学：一份综合指南

下游处理（Downstream processing, DSP）是生物制造中的一个关键阶段，涵盖了从复杂的生物混合物中分离和纯化目标产物所需的所有单元操作。此过程位于上游处理（Upstream processing, USP）之后，上游处理通过细胞培养或发酵生成产品。下游处理的效率和效果直接影响产品收率、纯度，并最终影响生物制药、酶、生物燃料和其他生物制品的商业可行性。

理解下游处理的基本原理

下游处理涉及一系列步骤，旨在将所需产物与细胞碎片、培养基组分和其他杂质分离开。这些步骤通常按顺序排列，以逐步浓缩和纯化目标分子。下游处理中采用的具体步骤取决于产品的性质、生产规模和所需的纯度水平。

下游处理的主要目标：

• 分离：将产品与大部分发酵液或细胞培养物分离开。
• 纯化：去除不需要的污染物，如宿主细胞蛋白（HCPs）、DNA、内毒素和培养基组分。
• 浓缩：将产品浓度提高到制剂和最终使用所需的水平。
• 制剂：将纯化后的产品制备成稳定且可用的形式。

常见的下游处理技术

下游处理中使用多种多样的技术，每种技术都为特定的分离和纯化挑战提供了独特的优势。

1. 细胞破碎

对于位于细胞内的产品，第一步是破碎细胞以释放产品。常见的细胞破碎方法包括：

• 机械裂解：使用高压均质机、珠磨机或超声波处理来物理性地破开细胞。例如，在生产*大肠杆菌*中的重组蛋白时，通常使用均质化来从细胞中释放蛋白。在一些大型设施中，可能会有多台均质机并行操作以处理大量物料。
• 化学裂解：使用去污剂、溶剂或酶来破坏细胞膜。这种方法通常用于对苛刻机械方法可能导致降解的更敏感的产品。
• 酶解：使用如溶菌酶之类的酶来降解细胞壁。这通常用于细菌细胞，提供比机械方法更温和的途径。

2. 固液分离

细胞破碎后，固液分离对于去除细胞碎片和其他颗粒物至关重要。常用方法包括：

• 离心：利用离心力根据密度差异分离固体和液体。由于其高通量和高效率，在大型生物工艺中被广泛使用。根据进料流的体积和特性，使用不同类型的离心机，如碟式离心机。
• 微滤：使用孔径范围为0.1至10微米的膜来去除细菌、细胞碎片和其他颗粒物。微滤通常用作超滤或色谱法之前的预处理步骤。
• 深层过滤：使用多孔基质在液体通过时捕获固体颗粒。深层过滤器通常用于澄清含有高细胞密度的细胞培养液。

3. 色谱法（层析）

色谱法是一种强大的分离技术，它利用分子在物理和化学性质上的差异来实现高分辨率纯化。下游处理中常用几种类型的色谱法：

• 亲和层析：利用目标分子与固定在固相支持物上的配体之间的特异性结合相互作用。这是一种高选择性的方法，通常用作初始纯化步骤。例如，His标签亲和层析被广泛用于纯化含有多组氨酸标签的重组蛋白。
• 离子交换层析 (IEX)：根据分子的净电荷进行分离。阳离子交换层析用于结合带正电的分子，而阴离子交换层析则结合带负电的分子。IEX常用于纯化蛋白质、多肽和核酸。
• 体积排阻层析 (SEC)：根据分子的大小进行分离。此方法通常用于精纯步骤，以去除目标分子的聚集体或片段。
• 疏水相互作用层析 (HIC)：根据分子的疏水性进行分离。HIC通常用于纯化对变性敏感的蛋白质。
• 多模式层析：结合多种相互作用机制以增强选择性和纯化效率。

4. 膜过滤

膜过滤技术用于浓缩、渗滤和缓冲液交换。

• 超滤 (UF)：使用孔径范围为1至100纳米的膜来浓缩产品并去除低分子量杂质。UF被广泛用于浓缩蛋白质、抗体和其他生物分子。
• 渗滤 (DF)：使用超滤膜从产品溶液中去除盐、溶剂和其他小分子。DF通常用于缓冲液交换和脱盐。
• 纳滤 (NF)：使用孔径小于1纳米的膜来去除二价离子和其他小分子带电物质。
• 反渗透 (RO)：使用孔径极小的膜，从水中去除几乎所有的溶质。RO用于水净化和高浓度溶液的浓缩。

5. 沉淀

沉淀法通过向溶液中添加试剂来降低目标分子的溶解度，使其从溶液中沉淀出来。常见的沉淀剂包括：

• 硫酸铵：一种广泛使用的沉淀剂，可以根据蛋白质的疏水性选择性地沉淀蛋白质。
• 有机溶剂：如乙醇或丙酮，可以通过改变溶液的介电常数来降低蛋白质的溶解度。
• 聚合物：如聚乙二醇（PEG），可以通过排挤蛋白质分子来诱导沉淀。

6. 病毒清除

对于生物制药产品，病毒清除是一项关键的安全要求。病毒清除策略通常包括以下组合：

• 病毒过滤：使用孔径足够小的过滤器来物理性地去除病毒。
• 病毒灭活：使用化学或物理方法来灭活病毒。常用方法包括低pH处理、热处理和紫外线辐射。

下游处理中的挑战

由于多种因素，下游处理可能是一个复杂且具有挑战性的过程：

• 产品不稳定性：许多生物分子对温度、pH和剪切力敏感，因此必须仔细控制工艺条件以防止降解。
• 产品浓度低：发酵液或细胞培养物中目标分子的浓度通常很低，需要显著的浓缩步骤。
• 混合物复杂：存在大量杂质，如宿主细胞蛋白、DNA和内毒素，这使得实现高纯度变得困难。
• 成本高昂：由于设备、消耗品和劳动力的成本，下游处理可能非常昂贵。
• 法规要求：生物制药产品受到严格的法规要求，需要广泛的工艺验证和质量控制。

优化下游处理的策略

可以采用多种策略来优化下游处理并提高产品收率和纯度：

• 工艺强化：实施策略以提高下游处理操作的通量和效率，例如连续色谱和集成工艺设计。
• 过程分析技术 (PAT)：使用实时监测和控制来优化工艺参数并确保产品质量的一致性。PAT工具可包括用于pH、温度、电导率和蛋白质浓度的在线传感器。
• 一次性技术：使用一次性设备以减少清洁验证要求并最小化交叉污染的风险。一次性生物反应器、过滤器和色谱柱在生物制造中越来越受欢迎。
• 建模与仿真：使用数学模型预测工艺性能并优化工艺参数。计算流体动力学（CFD）可用于优化生物反应器和其他工艺设备中的混合和传质。
• 自动化：自动化下游处理操作以减少体力劳动并提高工艺一致性。自动化色谱系统和液体处理机器人在生物制造中被广泛使用。

不同行业中下游处理的示例

下游处理的原理应用于各个行业：

• 生物制药：生产单克隆抗体、重组蛋白、疫苗和基因疗法。例如，胰岛素的生产涉及多个下游处理步骤，包括细胞裂解、色谱法和超滤。
• 酶制剂：生产用于食品加工、洗涤剂和生物燃料的工业酶。在食品工业中，淀粉酶和蛋白酶等酶通过发酵生产，然后使用下游处理技术进行纯化。
• 食品和饮料：生产食品添加剂、调味品和配料。例如，从发酵液中提取和纯化柠檬酸涉及沉淀和过滤等下游处理技术。
• 生物燃料：从可再生资源中生产乙醇、生物柴油和其他生物燃料。从玉米中生产乙醇涉及发酵，然后是蒸馏和脱水步骤来纯化乙醇。

下游处理的新兴趋势

下游处理领域在不断发展，新的技术和方法正在被开发出来，以应对生物制造的挑战。一些新兴趋势包括：

• 连续制造：实施连续过程以提高效率和降低成本。连续色谱和连续流反应器正被用于大规模生物制造。
• 集成生物工艺：将上游和下游操作结合成一个单一的集成过程，以最大限度地减少手动操作并改善过程控制。
• 先进色谱技术：开发新的色谱树脂和方法以提高选择性和分辨率。
• 人工智能和机器学习：使用AI和ML来优化下游处理过程并预测过程性能。机器学习算法可用于分析大数据集并识别最佳工艺参数。
• 3D打印：使用3D打印创建定制设计的分离设备和色谱柱。

下游处理的未来

下游处理的未来将由对更高效、更具成本效益和更可持续的生物制造过程的需求所驱动。新技术和新方法的发展，如连续制造、集成生物工艺和AI驱动的工艺优化，将在满足这一需求方面发挥至关重要的作用。

结论

下游处理是生物制造的关键组成部分，在各种生物产品的生产中扮演着至关重要的角色。通过理解下游处理的原理和技术，并采用创新的工艺优化策略，制造商可以提高产品收率、纯度，并最终提高其产品的商业可行性。下游处理技术的持续进步有望在未来几年进一步提高生物制造的效率和可持续性。从大型制药公司到小型生物技术初创公司，理解下游处理的科学对于在生物工艺行业取得成功至关重要。